【技术干货】ELISA实验第二关—操作细节

各位小伙伴有没有遇到过这样的情况：

明明严格按照步骤来，结果却总是差那么一点？

洗涤步骤到底要做到什么程度才算合格？

温育时间稍微有点偏差会不会影响结果？

显色反应的终止时机，到底怎么判断才最准确？

今天咱们就来好好唠唠那些 ELISA 实验里容易被忽略却又至关重要的操作要点，看看能不能解决大家的这些 “小烦恼”。

血清样本、抗原和抗体都需要稀释，稀释的准确性关系到检测的精确性。注意所用的移液器、吸头和容器一致。稀释完成后保证混合均匀。

加样时要加在板孔底部，避免加在孔壁和溅出，不能产生气泡。加入不同的物质时要更换吸头，避免交叉污染。在加显色液时，最好使用多道移液器，使加样时间尽量统一，减小结果误差。

洗涤主要目的是去除残留的未与固相载体上的抗原或抗体结合的物质、游离的酶标记物、以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体上的干扰物质等。如果洗涤不完全，可能会导致背景吸光度值偏高，从而影响实验结果的准确性。

洗涤次数 ：通常情况下，洗涤次数应不少于 3 次，部分实验要求洗涤 6 次或更多，以确保尽可能去除未结合的物质。

洗涤时间 ：洗涤过程中，洗液在孔中的停留时间也很重要，一般可选择 1 - 5 分钟的静止时间，让洗液充分作用，使各个孔的结合和洗涤情况趋于一致。

洗涤液量 ：洗涤液的量要足够，一般建议洗涤量使用 300 μl 及以上，且所有孔中的洗涤体积必须相等，以保证洗涤效果。

洗涤后残留 ：洗涤后，孔内不应有明显的残留液体或杂质，可通过观察孔内是否清澈、无残留物来初步判断。

孵育温度：不同品牌的试剂盒孵育温度不同，一般为37℃、室温或4℃。

孵育时间：孵育时间过长可能会导致非特异性吸附，过短可能导致抗体与抗原的结合不充分，一般孵育1-1.5h。

孵育环境：孵育过程中，环境湿度对实验结果也有一定影响。如果湿度较低，可能会导致孔板中的液体蒸发，影响孵育体积和浓度，进而影响检测结果孵育；对于一些使用碳酸盐缓冲液的 ELISA 实验，二氧化碳浓度也会影响孵育效果。二氧化碳可以与水反应生成碳酸，进而影响缓冲液的 pH 值。

所以孵育操作请严格按照试剂盒说明书进行。

显色是ELISA中的最后一步反应，酶催化底物产生显色反应。反应温度和时间是影响显色的关键因素。适当提高温度有助于加速显色，一般情况下，当标准品的高浓度孔（如 S1 孔）出现明显的颜色反应，如淡蓝色，而低浓度孔（如 S5 孔）也有淡淡的蓝色，同时空白孔（Blank 孔）无明显蓝色时，即可认为显色达到一定程度，可以终止反应。

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